◇“在我看來，此次嵌合猴成果對生命醫學的重要性不亞於克隆猴，是非人靈長類實驗動物模型製作的一個里程碑。”
◇胚胎幹細胞可以體外無限自我複製，對於製作攜帶疾病基因的非人靈長類實驗動物模型來説，胚胎幹細胞嵌合體技術有着其獨特的優勢
◇“我們的目標是盡快做出幾種腦疾病的猴模型，爭取在5年內向世界證實猴模型對醫藥研發有用。”
◇“已經有一些跨國公司&&到我們，希望以後在上海建立醫藥CRO公司，我們做出來猴模型可以給他們應用，這是一個未來産業。”
2018年1月25日，克隆猴“中中”和“華華”以封面文章形式登上國際學術期刊《細胞》，標誌着體細胞克隆技術首次在靈長類動物上實現。
五年後，由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（以下簡稱腦智卓越中心）牽頭的研究再次登上《細胞》封面，這一次，他們帶來了“嵌合猴”。
這是世界上首個用胚胎幹細胞構建的高比例嵌合猴。團隊將A猴的胚胎幹細胞注射到B猴的胚胎內細胞團中，再將嵌合胚胎植入C猴體內代孕，最終誕生的小猴由A猴胚胎幹細胞和B猴胚胎細胞共同分化而來，供體胚胎幹細胞的佔比高達70%左右。
“在我看來，此次嵌合猴成果對生命醫學的重要性不亞於克隆猴，是非人靈長類實驗動物模型製作的一個里程碑。”中國科學院院士、中國科學院腦智卓越中心學術主任蒲慕明接受《瞭望》新聞周刊記者採訪&&，胚胎幹細胞可以體外無限自我複製，對於製作攜帶疾病基因的非人靈長類實驗動物模型來説，胚胎幹細胞嵌合體技術有着其獨特的優勢。
嵌合猴是個大&階
“實驗動物是生命醫學的基礎。鼠類實驗動物模型之所以對生命醫學作出巨大貢獻，關鍵在於製作出了帶有特定疾病基因的小鼠品係。”此次研究的主角是猴，但蒲慕明從一隻獲得諾貝爾獎的小鼠講起。
小鼠品係，是經過長期繁殖和選擇得到，同一品係的小鼠在遺傳特徵和生理特性上高度一致，做藥物實驗時互為對照，便於排除干擾因素。
那麼，帶有特定疾病基因的小鼠品係是怎麼做出來的呢？
如果對一批小鼠的受精卵進行基因打靶，改變基因組中特定基因或者序列，由於打靶程度和靶點不完全相同，各個受精卵的基因也不同，並不能得到相同的疾病鼠。
蒲慕明介紹，美國分子遺傳學家馬裏奧·卡佩奇想到，可以把小鼠A和小鼠B的受精卵在體外發育到囊胚期。囊胚期是指卵子剛剛受精但尚未種植到子宮的階段，它由尚未分化的外胚層和內細胞團組成，外胚層未來會分化為胎盤，內細胞團則將分化為胎兒個體，具有發育全能性。
首先，對來自A的囊胚，馬裏奧·卡佩奇團隊首先把其中的內細胞團裏的細胞提取出來建成胚胎幹細胞係，通過基因打靶改變其特定基因。篩選出其中打靶準確的細胞大量擴增，從而得到一批完全相同的、基因改變的胚胎幹細胞。
第二，把這些來自A的胚胎幹細胞注射到B的囊胚內細胞團中，這樣就形成了一個嵌合胚胎，其內細胞團既有來自A的，也有來自B的。
第三，將嵌合胚胎植入小鼠C體內孕育，最終誕生嵌合小鼠。小鼠C並不對嵌合産生影響，只起到代孕作用。
“最關鍵的是嵌合體中兩種細胞的比例，供體細胞佔比要足夠大才能改變嵌合動物，這一點在鼠上做成了。”蒲慕明説。
胚胎幹細胞嵌合技術1984年在小鼠上誕生後，迅速成為幫助科學家確認單個基因在人類健康和疾病中作用的一大利器，帶來生命醫學界的重大革命，對這項技術作出重要貢獻的三位科學家馬裏奧·卡佩奇、馬丁·埃文斯、奧利弗·史密西斯因此在2007年獲得諾貝爾生理學或醫學獎。2008年，科學家在大鼠上也實現了胚胎幹細胞嵌合。
遺憾的是，胚胎幹細胞嵌合技術在靈長類上的研究進展十分緩慢。由於嚙齒類與靈長類存在巨大差異，一些人類疾病並不能在嚙齒類實驗動物上實現。猴作為與人類親緣最近的動物，被視為實驗動物模型的最佳選擇，但尚未有技術能製作出猴品係，實驗猴的成熟應用僅限於藥物安全實驗。
2012年，美國的靈長類實驗室曾得出實驗結論：猴的胚胎幹細胞不能形成嵌合體。之後幾年，中國科學院院士、昆明理工大學季維智團隊取得重要進展，他們通過研究得到過流産或出生的胚胎幹細胞嵌合猴，嵌合比例為0.1%～4.5%。
現在，世界首只胚胎幹細胞高比例嵌合猴誕生，向世界證實了猴模型的可能性。2023年11月9日，《細胞》以封面文章形式發表題為《高比例胚胎幹細胞貢獻的出生存活嵌合體猴》的研究成果，由中國科學院腦智卓越中心、上海腦科學與類腦研究中心劉真研究組，中國科學院腦智卓越中心非人靈長類研究&&孫強研究團隊和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院Miguel A. Esteban（米格爾·埃斯特班）研究組合作完成，獲得了科技部、中國科學院、上海市、自然科學基金委的資助。
審稿人評價，該研究結果是非凡的，因為提供了強大的證據證實靈長類胚胎幹細胞可以産生高比例的嵌合體動物，這在之前沒有得到明確證實。
解決三大難題，嵌合程度高達70%
記者採訪了解到，團隊為40隻代孕母猴移植了有明顯嵌合的囊胚，共獲得4隻流産的胚胎和6隻出生的小猴。檢測發現，其中1隻流産胚胎和1隻出生小猴有明顯嵌合，前者的胚胎幹細胞貢獻比例約20%，後者的胚胎幹細胞貢獻比例高達70%。
團隊進一步檢測發現，供體胚胎幹細胞可以跟受體胚胎細胞同步分化到猴的各種細胞譜係中。其中，腦細胞的嵌合程度最高，達到90%。“這意味着這項技術對於腦疾病的研究潛力巨大。”蒲慕明説。
“不僅如此，嵌合猴的胎盤組織和生殖細胞中也有胚胎幹細胞的高比例貢獻。”劉真説，胎盤組織和生殖細胞在胚胎發育和重編程過程中非常特殊。其中，胎盤組織由外胚層發育而來，小鼠胚胎幹細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，靈長類胚胎幹細胞可能具有不同於嚙齒類的獨特的發育全能性特徵。
生殖細胞發育過程中要經歷更加劇烈的表觀重編程，生殖細胞的高比例貢獻表明供體基因可以傳遞給下一代，這對後續基於該技術的遺傳修飾實驗猴模型構建至關重要。
世界首只胚胎幹細胞高比例嵌合猴為什麼能成功誕生？劉真及團隊告訴記者，主要是在前人研究的基礎上解決了三個難題：
一是獲得有高效發育潛能的猴胚胎幹細胞。小鼠的胚胎幹細胞有幼稚態和始發態兩種形態，其中幼稚態的發育全能性更強。但常規培養的靈長類胚胎幹細胞與小鼠胚胎幹細胞的始發態更接近，一定程度上表明，靈長類胚胎幹細胞的發育全能性天然更弱。
“培養液是關鍵。”劉真介紹，團隊廣泛研究各類用於幹細胞的培養液後，建立了處於6種不同培養體系下的食蟹猴胚胎幹細胞，發現5iLAF、4CL和PXGL培養體系下的幹細胞具有較高的多能性，而且4CL培養體系下的幹細胞具有更好的傳代穩定性和基因組穩定性。
二是解決胚胎幹細胞注入後快速凋亡的問題。由於胚胎發育條件和幹細胞培養條件不同，團隊需要避免胚胎幹細胞注射入受體胚胎後快速凋亡。
中國科學院腦智卓越中心聯合培養博士曹靜介紹，團隊選用4CL培養液下的胚胎幹細胞進行猴胚胎注射實驗，通過測試不同培養液和培養時間的組合，發現4CL培養液與胚胎培養液1:1混合可以得到最適合嵌合胚胎的培養條件。
三是嚴謹準確地檢測出嵌合比例。為了追蹤胚胎幹細胞，按照領域內常用的方法，團隊早在胚胎幹細胞植入胚胎前就將其標記上了綠色熒光蛋白，由胚胎幹細胞分化而來的細胞會表現出熒光。
除此之外，團隊建立了包含PCR擴增（聚合酶鏈式反應）、微衛星親子鑒定、基因組單核苷酸多態性深度測序、流式細胞儀檢測、綠色熒光蛋白檢測、免疫熒光檢測的一系列嚴格的嵌合體分析流程。劉真舉例説，小猴出生後，團隊首先用微衛星親子鑒定（類似人的親子鑒定）來確定嵌合猴確實攜帶來自胚胎幹細胞的信息，隨後用基因組單核苷酸多態性深度測序解析嵌合猴的基因組信息，從而區分胚胎幹細胞和原本胚胎細胞的比例。
此項研究嚴格遵守生物倫理規範，所有實驗均符合國際幹細胞研究學會的研究指南，並經過中國科學院腦智卓越中心倫理委員會審核。
規模化應用很快到來
鼠類模型有很多優勢，比如繁殖快、體積小、很多基因編輯的方法也很成熟，但其與人類的區別較大。以腦疾病研究為例，鼠腦沒有人腦那樣的溝回和腦區，很難用鼠類模型模擬神經系統疾病，包括但不限於孤獨症、老年癡呆症、帕金森症等。如果能用猴製作出成熟的疾病模型，那麼當下的許多疑難雜症研究治療有可能出現轉機。
蒲慕明介紹，針對不同疾病，有不同的模型製作方法。2018年，中國科學院腦智卓越中心製作出了世界首個體細胞克隆猴，次年利用該技術製作出了5隻腦疾病體細胞克隆猴，目前正與中國科學院上海藥物研究所合作開發治療腦疾病創新藥。2016年國際上第一個用轉基因技術做出來的孤獨症猴也出自這個研究團隊。
“現在我們開發了七八種不同的猴模型，但這些模型不是最好的，因為每只猴的個體差異太大。胚胎幹細胞嵌合技術有望得到沒有個體差異的疾病猴，從而推動猴模型走向規模化應用。”蒲慕明説。
從技術突破到真正建立疾病猴模型，需要多長時間？
猴模型的製作比鼠模型困難很多。僅從時間周期來看，小鼠20天出生，2個月性成熟，既可以傳代也可以用於研究。猴懷胎需要5個半月，性成熟則需要5年甚至更久。
猴模型的製作除了研發和構建模型技術外，還需要針對猴模型重新建立飼養空間、行為範式、測試體系等。
劉真介紹，下一步將對胚胎幹細胞進行基因打靶，也就是讓猴攜帶上特定的疾病基因，這是製造疾病猴模型的關鍵一步。此次成果證實了胚胎幹細胞高比例嵌合猴能做出來，即理論上基因打靶後再按照現在這個嵌合步驟就能做出疾病猴模型，但實際能不能、會遇到什麼問題還需要實踐去驗證。此外，中心有其他團隊關注相關的表型分析、疾病測試、藥物干預和認知研究。
“我們的目標是盡快做出幾種腦疾病的猴模型，爭取在5年內做出一些創新藥來，向世界證實猴模型對醫藥研發有用。”蒲慕明告訴記者，屆時，基礎研究團隊的成果將向下游推廣，憑藉猴模型上的獨家優勢吸引全球資源，“已經有一些跨國公司&&到我們，希望以後在上海建立醫藥CRO（醫藥研發外包）公司，我們做出來猴模型可以給他們應用，這是一個未來的産業。”（《瞭望》2024年第03期 《瞭望》新聞周刊記者 張建松 董雪）
