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厲害!LED照一照 “基因剪刀”就能指哪剪哪
2020-07-21 07:14:07 來源: 科技日報
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  基因編輯近年來廣受歡迎,使得科學家們可對基因進行簡單“操控”。但多年來,這一技術一直缺少一個能隨時開啟或關閉的按鈕。現在,我國科學家終于為“基因剪刀”創建了可行的光控開關——

  通過感光元器件實現對事物的控制,“光控”在現實生活中已慢慢普及,例如手機人臉識別解鎖、汽車霧燈自動開啟……這次被光操控的是基因編輯。我國科學家的這一研究成果近日發表在《科學·進展》雜志上。

  “LED發出的730nm(奈米)的遠紅光可激活係統進行基因編輯工作。”論文通訊作者、華東師范大學生命科學學院、醫學合成生物學研究中心研究員葉海峰對科技日報記者表示,只有在光照到的地方,基因的“編輯”“剪切”才會發生,從而真正做到指哪剪哪。

  創建關鍵元件 為基因編輯裝上自動開關

  CRISPR-Cas9基因編輯技術近年來應用廣泛,被形象地稱為“基因剪刀”,使得人類掌握了簡便可行的基因“操控術”。

  然而,要更便捷地操控基因編輯,需要一個“便捷按鈕”,讓人們按一下就能啟動,再按一下就能關閉,推動其走進“自動化時代”。尤其當基因編輯要走進臨床應用,必須要具有靈活、高精度的操控方法,才能使其更具安全性。

  “實現光控”需要在基因編輯前裝一個“光感裝置”用于“引爆”,這個裝置長什麼樣子?有哪些零件?

  在紅細菌中有一種蛋白BphS,它在接收到遠紅光的信號後會被激活,釋放一個信號。而在放線菌裏的蛋白BldD,接收到這個信號後能與DNA序列結合。

  “我看到這個資訊的時候,覺得非常興奮。前一種蛋白讓光和生物體‘接上頭’,後一種蛋白又‘連結’上了DNA。”葉海峰説,這種“跨界打通”意味著有很多工作可做,因為只要信號能傳導到DNA,就能推進生物學的操控。

  葉海峰團隊以放線菌中的BldD蛋白為基礎,將其親和DNA序列與哺乳動物的轉錄激活子融合,創制了一個雜交型的轉錄激活子,這一開關成為按下基因編輯“啟動鍵”的關鍵元件。

  這一元件的前方設置了光敏蛋白,接收光信號;後方連接上“基因剪刀”Cas9核酸酶。這個巧妙的設計使得整個係統只有感光後,才能夠啟動基因編輯。光控基因編輯的“圖紙”就此設計完成。

  驗證上百種序列 拼出遠紅光操控的編輯係統

  理論“圖紙”和關鍵元器件都已準備就緒,葉海峰團隊開始用合成生物學的方法對這些關鍵元器件進行組裝。

  令人意想不到的是,在細胞水準的驗證中,基因編輯並沒有因為光的有無而産生明顯的變化,遠紅光照射沒能刺激Cas9核酸酶的高量表達,熄滅光源也沒有阻止基因編輯工作。

  問題出在了哪裏?按照“圖紙”設計,整個流程應該是無懈可擊的。

  葉海峰百思不得其解。“這一研究工作我們持續推進了5年,有的關鍵性問題如果不能解決將會耽誤整個研究的進展。”葉海峰説,合成生物學要在活體內運轉,會有很多無法排查的意外。它不像編程,跑一遍會有糾錯,或者至少會提示哪個部分出現“BUG”。

  這次的“BUG”出現在哪裏?啟動基因的工作被相繼驗證。2017年、2018年,葉海峰課題組在《科學·轉化醫學》《美國科學院院刊》相繼發表論文,證明了遠紅光調控轉基因表達控制係統的可行性以及基因編輯CRISPR-dCas9酶的轉錄激活都是可行的。

  “我們試驗了各種方案,但整個係統的運作卻都失敗了。”葉海峰説,這個結果意味著需要對策略進行根本性的調整。

  直到有一天,葉海峰在《自然·生物技術》上看到一篇張鋒(基因編輯技術發明人之一)的文章,上面説基因編輯的Cas9核酸酶可以一拆為二,拆開來之後的兩半再合起來也是有功能的。

  “受到這樣的啟發,我們就想可不可以把它拆成兩半,一半是連續的強表達(自始至終一直表達),另一半用光碟機動調控來表達。”葉海峰説,就像“鑰匙”的兩半拼在一起才能開鎖一樣。

  “拼”這個動作又要怎麼自動實現呢?葉海峰想到了熱纖維梭菌中的一對能夠自發相互結合的蛋白Coh2和DocS。讓它們加入進來,分別與Cas9的兩部分融合,Coh2和DocS就會像“磁石”一樣,將Cas9的兩部分拼裝成完整、有功能的Cas9核酸酶。

  “究竟是哪一半用光來調控誘導表達,都是有説法的。”葉海峰回憶,課題組對多種情況進行了試驗,至少進行了上百種不同序列的驗證,以尋找最佳光控基因編輯效果。

  “我們還對整個係統進行了優化,例如質粒的濃度配比,核輸入信號和核輸出信號的選擇及組合等,並在細胞水準進行了測試。”葉海峰説,經過嚴謹的優化,實驗結果最終令人滿意,並將其命名為“FAST係統”。

  研究結果顯示,FAST係統在LED發射的低強度遠紅光照射下可以誘導細胞內的基因編輯,而在黑暗情況下保持“靜默”的效果也很好。

  進一步研究表明,FAST係統在多種細胞中均顯示出可調控的基因編輯效果,並具有很好的光照強度和時間依賴性,以及高度的時空特異性,為研究FAST係統在動物體內的可調控基因編輯能力奠定了基礎。

  “我們至今也不太清楚為什麼直接調控表達完整Cas9核酸酶的係統不成功。”葉海峰説,不按程式走,這就是生命科學的神奇之處,而合成生物學正是在破解這些意外中積累起來,最終解決更大的科學命題。

  光照時間太長 活體高效遞送還需“打怪升級”

  生命體是復雜的,在細胞水準運轉良好的係統在活體中能不能工作,仍面臨著重重挑戰。為此,在進行了細胞驗證後,研究團隊還進行了轉基因報告模型小鼠和腫瘤模型小鼠的驗證工作。

  “讓整個係統在活體中工作,會遇到新的問題,比如遞送的問題。”葉海峰解釋,FAST係統由好幾個質粒組成,它們進入細胞比較簡單,但能不能突破重重阻礙進入到組織細胞裏面呢?比如高效遞送到肝臟和腫瘤組織裏面,就需要借助于遞送係統,而且遞送的效率直接決定整個係統的工作效率。

  “研究推進時,遞送技術是又一個難題,我們最初直接通過靜脈注射,效果卻不是那麼好。”葉海峰説,“細胞中工作的質粒在進入活體的時候受到了阻礙,因為整個係統承載的元件太多,所有元件同時遞送的效率不能保證,且質粒會被機體認為是外來物而被清除掉。”

  想進入活體,整個係統還需要再調整。“這就好比原來坐的卡車太大了、目標明顯,需要換乘一個‘特洛伊木馬’潛進去。”葉海峰説。

  研究團隊後來在合作團隊的幫助下,使用另一種更小的、能夠整合進細胞裏的質粒進行遞送工作。實驗結果中,轉基因小鼠在肝臟部位顯示出了基因編輯的報告情況,表明小鼠肝臟細胞中DNA可通過光控編輯。

  實體瘤是比組織器官更致密的組織,進入其中則需要進一步升級遞送係統。

  “為了把FAST係統高效遞送到腫瘤組織細胞裏面,我們與浙江大學專門制作DNA分子遞送的團隊合作,用奈米技術合成的材料實現了向腫瘤組織的高效遞送。”葉海峰説。

  在腫瘤小鼠模型中的驗證結果顯示,將FAST係統遞送至小鼠體內的腫瘤後,通過遠紅光LED的照射,FAST係統能切割腫瘤致癌基因,從而顯著抑制腫瘤的生長。

  再好的技術只有走進應用才能實現價值。“之所以希望實現光控,初心就是希望推進廣泛的應用。”葉海峰説,實驗也證明了遠紅光可以透過小鼠的皮膚進入到小鼠的肝臟內部,甚至進入到實體瘤內部。這意味著FAST係統有疾病治療的應用潛力。

  葉海峰表示,團隊仍在進一步優化光控基因表達係統,例如現在的光控係統需要光照2小時才能工作,而未來希望得到改進後,照射幾秒就能産生效果。(張佳星)

【糾錯】 責任編輯: 張樵蘇
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