新華網 正文
長期被誤解 非編碼RNA存在“認知黑洞”
2018-05-08 12:48:12 來源: 科技日報
關注新華網
微博
Qzone
評論
圖集

  長期被誤解 非編碼RNA存在“認知黑洞”

  在人類基因組中95%的基因並不編碼蛋白質,其他物種也有大量的非編碼基因。這些DNA不會被編碼成蛋白質,卻又會轉錄出非編碼RNA,它們對生命活動起什麼作用?是進化的冗余還是神秘的緩存?

  《細胞》雜志近日刊登中國工程院院士曹雪濤團隊的研究論文,他們發現一種全新非編碼RNA分子。該分子能夠調控免疫係統的“進”與“退”,這是此前學術界從未認識和證明的。

  “由于長鏈非編碼RNA(lncRNA)豐度低,業界對其功能爭議很大。”浙江大學生命科學研究院教授徐平龍在此前接受採訪時評價道,但此次發表的研究嚴謹地鑒定了所發現的一種全新lncRNA是有功能的,即能夠進行免疫調控,而曹雪濤院士正是這一機制的主要開拓者之一。

  大海撈針 從浩淼細胞中層層篩選而出

  細胞雖小,卻瀚如乾坤。尋找一個不知道存不存在的RNA分子,如大海撈針。

  到哪裏找線索?病毒感染給了曹雪濤啟示。談到為什麼會從病毒這個“敵人”的角度考慮。曹雪濤講道:“我們中國文化講,陰中有陽、陽中有陰,這是外國人很難理解的。這一哲理指導我們對免疫係統的理解就是,激活和抑制很可能會交融在一處,那麼我們就從這個‘交融點’突破解題。”

  既然體內蛋白能夠識別外來的病毒RNA,能不能識別體內自身RNA呢?

  科學界大部分認為不能。“免疫係統擁有識別‘自我’‘非我’的能力,就好像邊境衛士,對外來的侵害反應敏感,對轄內‘居民’熟視無睹。”曹雪濤院士團隊成員之一、中國醫學科學院基礎醫學研究所教授姜明紅説,“但是曹老師並不這麼看,他説,究竟是不是熟視無睹,你要證明才行。”

  在中國傳統哲理思想的指引下,曹雪濤鎖定了一個已知的關鍵蛋白——“RIG-I”,求證這個能與病毒RNA結合的蛋白,會不會和體內自身的RNA分子結合。

  RIG-I很像一個分子水平的“老鼠夾子”,2011年有科學家解析了這個蛋白的分子結構,發現“老鼠(病毒RNA)”沒來的時候,夾子合著,兩頭的結構域相互作用,蛋白處于“閉合”狀態;一旦“老鼠”來了,與夾子的一頭結合,另一頭就會“彈開”,蛋白遂處于激活狀態。而這樣的構象變化,會引發細胞合成出關鍵的抗病毒分子——幹擾素,幹擾素分泌後被周圍細胞接受,引發抗病毒的“連鎖反應”。

  研究團隊通過紫外加強RNA結合蛋白免疫沉淀(UV-RIP)的方法,將“老鼠夾子”和它獵捕的“老鼠”同時從細胞中分離出來。隨後通過蛋白質變性等方法,把“老鼠夾子”過濾掉,就獲得與RIG-I結合的所有RNA。

  夾子“釣”上來的所有RNA中,有沒有未被發現的有功能的lncRNA呢?

  將“撈針”的范圍鎖定夾子“釣”上來的RNA後,團隊又通過設計對應的幹擾實驗繼續縮小范圍,即看究竟哪個RNA被封殺之後,免疫活動不再被抑制。功能篩選幫助團隊鎖定了一批備選者並列出“排名”。排名靠前的RNA分子,且與特定信號通路相關的lnc-Lsm3b被鎖定,一個新的RNA分子從浩淼的小鼠巨噬細胞中經過層層篩選被“打撈”上來,並獲得了確切的序列。

  團隊後續開展了多角度的證明工作,如通過幹擾、敲除、過度表達等技術,反復證明lnc-Lsm3b能夠在病毒感染的細胞中,通過“分子誘餌”的方式鎖定RIG-I,使其不與病毒RNA結合。

  海量實驗 頂級期刊的尖銳難題被逐個攻克

  全新的發現,使得團隊興奮異常。沒想到的是,更大的磨礪還在後面。

  團隊向頂級期刊投稿,審稿人卻要求必須用CLIP(交叉互連免疫沉淀)技術明確RNA的哪一個點和蛋白質相互作用,連接在一起。用語言很難解釋蛋白質和RNA在活體細胞內錯綜復雜的關聯,姜明紅給科技日報記者畫圖:一個長鏈RNA會結合多個蛋白,這些蛋白有的是特異連接,連得緊密,有的就是“挂”在上面,而蛋白之外還會帶上其他的RNA,“纏繞”“連帶”“虛實”……

  CLIP很難做,國內實驗室極少有成熟的經驗。收到修改意見後的團隊成員開始大量查閱論文。“國外的實驗流程無法完全照搬,不同的細胞做法不同,需要重新摸條件。”團隊中主要攻關這一技術的劉倫説。

  CLIP技術和RIP(RNA結合蛋白免疫沉淀)技術類似,但是卻能夠達到單個鹼基的分辨率。為此,通過海量實驗,針對裂解液的成分如何影響細胞內物質,團隊開始了如指掌;不同RNA酶的脾氣也熟練掌握。

  “實驗室的部分我們自己攻克了,但是測序公司表示無法進行匹配的測序工作,原因是無法合成特有的適當引物。”劉倫説,國內沒有公司生産CLIP所需引物,而RNA測序必須先反轉錄為cDNA才能夠進行,引物決定了反轉錄的準確性,決定了目標位點能否確定。實驗室自己擔負起RNA轉錄、構建cDNA文庫的工作。完成3代測序、用化學方法測量分子間的相互作用力……這些免疫研究實驗室原本並不擅長的難題被團隊逐個攻克。

  按圖索驥 摸索並掌握一套獨有技術體係

  根據已有發現,團隊按圖索驥,利用分子篩層析實驗證實缺失lnc-Lsm3b表達的巨噬細胞在感染病毒以後,多聚化的RIG-I蛋白顯著增加。他們推測,病毒RNA與RIG-I結合以後,能夠誘導RIG-I單體形成多聚化狀態,從而激活下遊信號通路。而lnc-Lsm3b只與單體結合,可能是通過抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

  “Lsm3b只能結合單體的RIG-I蛋白、一條鏈能結合9個蛋白、結合力比病毒RNA高……”這些都是對這個全新RNA分子的多角度了解。

  如同向“黑洞”中打進一束光,曹雪濤團隊在對現有知識體係顛覆的同時,肯定地回答了學界之前關于這類自身RNA分子是否存在、功能幾何的爭議。

  “過去我們用別人的技術進行實驗,現在我們自己摸索並掌握一套獨有的技術。”曹雪濤説,整個研究的“練兵”不僅拓展了人類的“知識域”,還拓展了實驗室的思路和眼界。接到《細胞》雜志編輯部發來修改要求時感受到的“不可思議”和巨大壓力,團隊成員現在已能笑談。

  “只是這段RNA與人類的同源性很低。”姜明紅表示了小小的惋惜,這意味著,該發現無法直接應用于人類的新藥創制領域,但是,其他擁有人源細胞材料的機構,可以沿著這條路,進一步發現人類機體內是否存在相似的RNA。曹雪濤更看重的是,確定靶點的方法一旦被高質量地掌握,就能夠確定蛋白質的靶點,進而確定藥物作用的靶點,助力抗病毒藥物的研發。 (記者 張佳星)

+1
【糾錯】 責任編輯: 李海韻
新聞評論
加載更多
強降雨來襲 廣東多地暴雨預警
強降雨來襲 廣東多地暴雨預警
新疆遭遇寒潮天氣
新疆遭遇寒潮天氣
加緊制造蒙華鐵路軌排
加緊制造蒙華鐵路軌排
鄱陽湖上的江豚“保鏢”
鄱陽湖上的江豚“保鏢”
010030090900000000000000011101051122800419